Javascript is currently disabled in your browser.Cum JavaScript debilitatur, aliqua functiones huius paginae laborare non vult.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodericus Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Pell Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Hispania. collatio collativa: acidum hyaluronicum (HA) naturaliter occurrens est polysaccharide adhibita in productione fillers dermal ad aestheticos fines.Cum dimidia vita plurium dierum in fibris humanis habet, HA-fundatur fillers dermal, chemica modificatur ad vitam suam in corpore extendendam.Frequentissima modificatio in fillers commerciali HA fundatis est usus aetheris diglycidylis 1,4-butanedioli (BDDE) sicut agentis transversim ad vincla ligandi HA.Residua vel unreacted BDDE consideratur non-toxicus in <2 partibus per decies centena millia (ppm);ergo residua BDDE in fillore finali dermal quantitatis ad salutem patientem praestanda est.Materiae et methodi: Hoc studium detectionem et characterizationem describit by-producti reactionis crucis inter BDDE et HA sub alcalicis conditionibus componendo, liquidam chromatographiam et spectrometriam massam coniungendo (LC-MS).Proventus: Post varias analyses, inventum est condiciones alcalina et caliditas in usu hydrogel HA-BDDE disinficere, formationem huius novi operis, "propylene glycol-simile" compositi.Analysis LC-MS confirmavit eandem massam monoisotopicam quam BDDE, alium retentionis tempus (tR), aliumque UV absorbance (λ=200 um) habere.Dissimilis BDDE, in analysi LC-MS observatum est, sub iisdem condicionibus mensuratis, hoc facto uberiorem deprehensionem in 200 nm habere.Conclusio: Hi eventus indicant non esse epoxidem in structura huius compositi novi.Discussio aperta est aestimare periculum huius operis novi operis inventi in productione hydrogeli HA-BDDE (HA dermal filler) negotii causa.Keywords: acidum hyaluronicum, HA filler dermal, acidum hyaluronicum cross-connexum, BDDE, LC-MS analysis, BDDE per-productum.
Fillers innixus acido hyaluronico (HA) sunt frequentissimae et populares fillers dermal ad cosmeticos usus.1 Hic filler dermal hydrogel est, plerumque ex 95% aqua et 0.5-3% HA compositus, qui structuram gel-similem dat.2 HA polysaccharida est et principale elementum matricis extracellulares vertebratum.Unius rei.Constat ex (1,4)-acidi glucuronico-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) repetita disaccharide unitates vinculorum glycosidicorum connexorum.Haec disaccharide forma in omnibus organismis eadem est.Comparata cum nonnullis interdum-substructis fillers (ut collagen), haec proprietas moleculum biocompatibile valde HA facit.Hi fillers amino acidi speciem praebere possunt specificitatem quae ab immune systemate patientis cognosci potest.
Cum usus est ut filler dermal, limitatio principalis HA est eius celeri materia prima in fibras ob praesentiam specificae familiae enzymorum quae hyaluronidases vocantur.Hactenus nonnullae modificationes chemicae in structura HA descriptae sunt ut dimidia vita HA in fibris augeatur.3 Pleraque harum modificationum accessum hyaluronidasi ad polysaccharidum polymerorum per transversis vinculis HA vinculis reducere conantur.Ideo, ob pontium institutionem et intermoleculares nexus inter HA structuram et covalentes nexus agentis, crux HA hydrogel coniunctio plus odii enzyme degradationis productorum quam naturales HA producit.4-6
Hucusque agentibus chemicis crosslinking connexis HA producere solebant methacrylamide, 7 hydrazide, 8 carbodiimide, 9 sulfone diviny, 1,4-butanediolum diglycidyl aether (BDDE) et poly(ethylenum glycol) et aether diglycidyl.10, 11 BDDE in actu vulgo crosslinking usus est.Etsi haec genera hydrogelorum per decenniis tuta esse probata sunt, agentibus transversis adhibitis reagentes reactivas quae cytotoxicae sint et, in casu, mutagenicae sint.12 Ergo earum residua contenta in hydrogel finali alta esse debet.BDDE tutum censetur cum concentration residua minor quam 2 partium per decies centena millia (ppm).4
Plures modi sunt ad detegendam retractationem low-residuum BDDE, gradum transversalem et substitutionem positionis in hydrogelis, sicut chromatographia gasi, amplitudo exclusio chromatographia cum spectrometria massa (MS), resonantia magnetica (NMR), fluorescens methodus mensurae et nuclei Diode ordinata iuncta alta perficiendi fina liquida (HPLC).13-17 Hoc studium detectionem et characterisationem operis by-producti in finali connexo HA hydrogel designat, per reactionem BDDE et HA sub condicionibus alkalinis producti.HPC et liquida spectrometriae chromatographia-massa (analysis LC-MS).Cum toxicitas huius operis BDDE sit incognita, commendamus reliquam eius quantitatem simili modo determinari ad methodum quae in BDDE in producto finali fieri solet.
Sal sodium nactus HA (Shiseido Co, Ltd., Tokyo, Japan) hypotheticum pondus habet ex ~1,368,000 Da (Modo Laurent) 18 et viscositas intrinseca 2.20 m3/kg.Pro crosslinking reactionem, BDDE (≥95%) emptus est a Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA).Phosphate buffered salinum cum pH 7.4 emptus est e Societatis Sigma-Aldrich.Omnia menstrua, acetonitrile et aqua in analysi LC-MS adhibita ab HPLC gradu qualitate empta sunt.Acidum formicum (98%) pro gradu gerente emitur.
Omnia experimenta in systemate Acquity UPLC (Aquae, Milford, MA, USA) fiebant et cum API 3000 quadrupolorum massae spectrometri triplicem connexum cum fonte ionizationis electrospray instructum (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Synthesis hydrogelorum in transversis connexis HA incepit addere 198 mg BDDE ad 10% (w/w) sodium hyaluronatum (NaHA) solutionis coram 1% alcali (hydroxis natrii, NaOH).Postrema BDDE intentio in mixtione reactionis erat 9.9 mg/mL (0.049 mM).Deinde mixtionis reactionem permixtam et homogenatam permiscuimus ad 45°C per 4 horas procedere.19 pH reactionis conservatur apud ~12.
Deinceps reactionem mixtionis aqua abluta est, et hydrogel ultimus HA-BDDE cum PBS percolatur et diluitur quiddam ad consequendam intentionem HA 10 ad 25 mg/mL, et ultima pH 7.4.Ut sterilitatem efficiant hydrogelorum HA cross-coniunctim, omnes hi hydrogeli autoclavati sunt (120°C per 20 minuta).Purificatus BDDE-HA hydrogel in 4°C conditur usque ad analysin.
Ad analysim BDDE praesentem in productum cum cruce HA, a 240 mg specimen appensum et in medium foramen introductum (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volumen 0,5 mL) et centrifuga ad 10,000 rpm ad locus temperatus 10 minute.Summa 20 µL liquidae pulli descendentis collecta est et resolvitur.
Ut vexillum BDDE (Sigma-Aldrich Co) analysis sub conditionibus alcalicis (1%, 0,1% et 0.01% NaOH), si condiciones sequentes occurrant, liquidum specimen est 1:10, 1:100, vel usque ad 1:1,000,000 Si opus est, aqua MilliQ deionizata pro analysi utere.
Ad initium materiae adhibitae in reactionem crucis-coniunctio (HA 2%, H2O, 1% NaOH, et 0,049 mM BDDE), 1 mL uniuscuiusque specimen ex his materiis praeparatis per easdem analyseos condiciones enucleatum est.
Determinare cacuminum specificitatem in tabula ionali apparentibus, 10 µL solutionis normae 100 ppb BDDE (Sigma-Aldrich Co) addita est 20 µL sample.In hoc casu, finalis intentio vexillum in singulis specimen est 37 ppb.
Primo, para solutionem stirpis BDDE cum concentratione 11000 mg/L (11000 ppm) diluendo 10 μL vexillum BDDE (Sigma-Aldrich Co) cum 990 µL MilliQ aquae (densitatem 1.1 g/mL).Hac solutione utere, ad solutionem 110 µg/L (110 ppb) BDDE parandam ut regulam intermediam dilutionem.Deinde utere vexillum intermedium BDDE diluentem (110 ppb) ad parandum curvam regulam pluries diluendo diluendo pluries ad optatam intentionem 75, 50, 25, 10, et 1 ppb.Ut in Figura 1, patet, invenitur regulam BDDE curvam ab 1.1 ad 110 ppb bonam habere linearitatem (R2>0.99).Vexillum curvae in quattuor experimentis independentibus repetitum est.
Figura 1 curvae calibrationis vexillum BDDE ab analysi LC-MS impetratum, in quo bene observatur correlatio (R2>0.99).
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa.
Ut signa BDDE cognoscerent et quae in crucis connexione HA et signa BDDE in solutione basi solutionis notarentur, adhibita analysi LC-MS.
Separatio chromatographica in LUNA 2.5 µm C18(2)-HST columna facta est (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) et in analysi locus temperatus (25°C) custoditus est.Phase mobile ex acetonitrili (solutione A) et aqua (soluta B) consistit, continens 0.1% acidum formic.Mobilis periodus per elationem gradientem eluditur.Clivus hoc modo est: 0 minuta, 2% A;minutis 1, 2% A;6 minuta, 98% A;7 minuta, 98% A;7.1 minuta, 2% A;X minuta , 2% A. Tempus breve est 10 minuta et iniectio volumen est 20 µL.Tempus retentionis BDDE est circa 3.48 minuta (a 3.43 ad 4.14 minuta experimentis innixa).Tempus mobile exantlabatur ad rate of fluxus 0.25 mL/min pro analysi LC-MS.
Analysis enim BDDE et quantitatis per MS, systema UPLC (Aquae) componitur cum API MMM triplo spectrometro quadrupoli massae (AB SCIEX) instructa electrospray fonte ionizatione, et analysis modo positivo ionis conficitur (ESI+).
Secundum analysin fragmenti ion in BDDE positi, fragmentum summa cum vehementia definitum est fragmentum 129.1 Da (Figura 6).Ergo in multi-ion vigilantia quantitatis (MIM) quantitatis, massa conversio (proportio massae ad crimen [m/z]) ipsius BDDE est 203.3/129.1 Da.Etiam plenam scan (FS) modum et ion producti scan (PIS) utitur modo pro analysi LC-MS.
Ad specificationem methodi comprobandam, specimen blank (phasis mobile initialis) enucleatum est.Nullum signum in blank specimen deprehensum cum massa conversionis 203.3/129.1 Da.Quoad experimenti iterabilitatem, 10 injectiones mensurae 55 ppb (in medio curvae calibrationis) evolutae sunt, inde in vexillum residua declinationis (RSD) <5% (notitia non exhibita).
Contentum residua BDDE quantitum erat in hydrogelis octo diversis autoclavatis BDDE cruce connexis HA, quatuor experimentis independentibus respondens.Ut in sectione "Materiarum et Methodorum" describitur, quantitatio aestimatur mediocris valoris regressionis curvae vexillum dilutionis BDDE, quae respondet unico cacumine detecto in BDDE massae transitus 203.3/129.1 Da, cum retentione. tempus 3.43 ad 4.14 minuta Non exspectat.Figura 2 exemplum exhibet chromatogrammi 10 ppb BDDE vexillum referentis.Tabula 1 summatim residua BDDE contentum octo hydrogelorum diversorum.Valor ambitus est 1 ad 2.46 ppb.Ergo, intentio residua BDDE in specimen acceptum usui humano (<2 ppm).
Figura 2 Ion chromatogrammum 10 ppb BDDE vexillum referens (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) transitus LC-MS consecutus ab analysi 203.30/129.10 Da (in modo positivo MRM).
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;MRM, multiplex reactionis vigilantia;MS, molem;m/z, massa-ad-crimen ratio.
Nota: Exempla 1-8 autoclavatae sunt BDDE crucesignatae HA hydrogelae.Etiam copia residua BDDE in hydrogel et apicem retentionis BDDE relata est.Denique exsistentia novorum cacumina diversis retentione temporibus etiam traditur.
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;HA, Acidum hyaluronicum;MRM, multiplex reactionis vigilantia;tR, retentio temporis;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;rrt, relativum temporis retentione.
Mire, analysis chromatogrammi LC-MS ion demonstravit quod in omnibus exemplaribus hydrogelii enucleatis in autoclavatis cross-connexis HA, extra apicem in breviore retentione temporis 2.73 ad 3.29 minutarum facta est.Exempli gratia, Figura 3 chromatogrammi ion chromatogrammi affixi HA specimen ostendit, ubi additamentum apicem diverso retentionis tempore circiter 2.71 minutarum apparet.Observata relativa retentio temporis inter nuper observatum apicem et apicem ab BDDE repertum est 0.79 (Tabula 1).Cum Scimus noviter observatum apicem minus retineri in columna C18 in analysi LC-MS adhibita, novum cacumen magis composito polare quam BDDE respondere potest.
Figura 3 Ion chromatogramma crucis-connexum HA hydrogelii specimen ab LC-MS consecutum (MRM massa conversionis 203.3/129.0 Da).
Abbreviations: HA, acidum hyaluronicum;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;MRM, multiplex reactionis vigilantia;rrt, relativum tempus;tR, retentio temporis.
Ad excludendum facultatem ut nova culmina observata contaminantes primitus adsint in rudibus materiis adhibitis, hae quoque materiae rudis eadem methodo analysi LC-MS enucleata sunt.Materiae primae analysi includunt aquam, 2% NaHA in aqua, 1% NaOH in aqua, et BDDE in eadem intentione adhibita in crucis-connexione reactionis.Ion chromatogramma incipientis materiae adhibitum nullum compositum vel apicem ostendit, eiusque retentio tempus respondet novo cacumine observato.Hoc facto reicit opinionem non solum materiae principium inesse aliquas compositiones vel substantias quae analysi modo impedire possunt, sed nullum signum est crucis-contaminationis possibilis cum aliis productis laboratorium.Valores retrahitur post LC-MS analysin BDDE consecuti ac novorum cacumina in Tabula 2 (specimina 1-4) et chromatogramma in Figura IV.
Nota: Exempla 1-4 respondent materiae rudis adhibitae ad hydrogelos HA autoclavatos BDDE cruce connexos.Exempla haec autoclavata non sunt.
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;HA, Acidum hyaluronicum;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;MRM, multiplex reactionis magna vigilantia.
Figura 4 respondet LC-MS chromatogrammi exempli materiae rudis adhibitae in cross-connexione reactionis HA et BDDE.
Nota: omnia haec eadem intentione ac ratione mensurantur ut reactionem cross-coniunctio exerceat.Numeri ad materias crudas per chromatogram resolutas respondent: (1) aqua, (2) 2% HA solutio aquea, (3) 1% solutio aquea NaOH.Analysis LC-MS exhibetur pro missa conversione 203.30/129.10 Da (in modo positivo MRM).
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;HA, Acidum hyaluronicum;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;MRM, multiplex reactionis magna vigilantia.
Conditiones quae ad novorum cacumina formanda erant investigata sunt.Ut consideret quomodo condiciones reactionis adhibitae ad crucis connexum HA hydrogel producendum afficiunt reactivitas agentis transversi BDDE, ducens ad novorum cacumina formationes (posse by-products), diversae mensurae fiebant.In his determinationibus studuimus et enucleavimus crosslinkem finalem BDDE, quae tractata est cum diversis concentratione NaOH (0%, 1%, 0.1%, et 0.01%) in medio aqueo, subsecuto vel sine autoclavatione.Bacteria procedendi ad easdem condiciones simulandas eadem est ac methodus usus ad HA hydrogel cross-coniunctum producendum.Sicut in sectione "Materials et Methodi" describitur, massa transitus exempli a LC-MS ad 203.30/129.10 explicatur.BDDE et concentratio novi cacuminis computantur et eventus in Tabula monstrantur 3. Nullae novae apices deteguntur in exemplaribus quae non autoclavata erant, quantumvis praesentiae NaOH in solutione (exempla 1-4, Tabula. 3).Ad exempla autoclavata, novae apices tantum coram NaOH in solutione deprehenduntur, et formatio cacuminis pendere videtur ab intentione NaOH in solutione (exempla 5-8, Tabula 3) (RRT = 0.79).Figura 5 exemplum chromatogrammi Ionis ostendit, duo exempla autoclavata exhibens in praesentia vel absentia NAOH.
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;MRM, multiplex reactionis magna vigilantia.
Nota: summum chromatogrammum: sample NaOH solutionem aqueam 0.1% tractatam et autoclavatam (120°C pro 20 minutis).Imo chromatogrammum: specimen cum NaOH non tractatum, sed sub iisdem conditionibus autoclavatum.Massa conversio 203.30/129.10 Da (in modo positivo MRM) a LC-MS resolvitur.
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;MRM, multiplex reactionis magna vigilantia.
In omnibus speciminibus autoclavatis, cum vel sine NaOH, intentio BDDE valde redacta est (exemplaria 5-8, tabula 2).Deminutio in BDDE retrahitur ob hoc quod aqua in calidis temperaturis turpia (nucleophile) agere potest ut anulum epoxidum BDDE aperiat ut mixtum 1,2-diol componat.Qualitas monoisotopicum compositi huius ab BDDE differt ac propterea non patitur.LC-MS transpositio massam deprehendit 203.30/129.10 Da.
Denique haec experimenta ostendunt generationem novorum cacumina pendere coram BDDE, NAOH et processu autoclavante, sed nihil ad HA.
Novus cacumen inventus in retentione hora circiter 2.71 minuta tunc a LC-MS denotata erat.Ad hoc, BDDE (9.9 mg/mL) incubatum erat in solutione aquea NaOH 1% et autoclavatis.In Tabula 4, characteres novi cacuminis comparantur cum noto BDDE ad apicem referentis (retentionis temporis circiter 3.47 minutae).Ion analysi ruptionis duorum cacumina fundata, colligi potest apicem cum retentione temporis 2.72 minutarum demonstrare eadem fragmenta ac apicem BDDE, sed cum diversis intensitatibus (Figura 6).Nam apicem retentioni temporis 2.72 minutorum respondens, apicem intensiorem observatum est post ruptionem in massa 147 Da.Ad BDDE retrahitur (9.9 mg/mL) in hac determinatione adhibitae modi absorbance diversi (UV, λ=200 um) in spectro ultraviolaceo observati sunt etiam post separationem chromatographicam (Figura 7).Vertex cum retentione tempore 2.71 minutorum adhuc CC um conspicuus est, dum BDDE apicem in chromatogrammis iisdem conditionibus observari non potest.
Tabula 4 Characterization eventus novi cacuminis cum retentione temporis circiter 2.71 minutarum et BDDE apicem cum retentione temporis 3.47 minutarum
Nota: Ad hos proventus obtinendos analyses LC-MS et HPLC (MRM et PIS) factae sunt in duobus iugis.Pro analysi HPLC, UV detectio cum nece 200 um adhibetur.
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;HLP, altum perficiendi liquidum chromatographiam;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;MRM, multiplex reactionis vigilantia;m/z, massa-ad-crimen ratio;PIS, product Ion scanning;lux ultraviolacea, lux ultraviolacea.
Nota: fragmenta massae ab analysi LC-MS obtinentur (PIS).Top chromatogrammum: spectrum massae BDDE vexillum specimen fragmentorum.Imo chromatogrammum: Massa spectri novi cacuminis detecta (RRT cum BDDE cacuminis coniungitur 0.79).BDDE processit in 1% NaOH solutione et autoclavato.
Abbreviationes: BDDE, 1,4-butanediolum diglycidyl aether;LC-MS, chromatographia liquida et spectrometriae massa;MRM, multiplex reactionis vigilantia;PIS, product ion scan;rrt, relativum temporis retentione.
Figura 7 Ion chromatogrammum 203.30 Ion Da praecursoris, et novum apicem cum retentione tempore 2.71 minutorum et (B) UV detectio BDDE referens apicem vexillum ad 3.46 minuta ad 200 nm.
In omnibus nexibus HA hydrogelis productis, animadversum est de intentione residua BDDE post LC-MS quantitatem <2 ppm fuisse, sed novum apicem ignotum in analysi apparuit.Hoc novum apicem vexillum productum BDDE non congruit.Vexillum BDDE productum eandem qualitatem conversionem subiit etiam (MRM conversion 203.30/129.10 Da) analysin in modo positivo MRM.Fere aliae methodi analyticae sicut chromatographiae adhibitae sunt ut limites probationum ad deprehendendum BDDE in hydrogelis, maximus autem modus deprehendendi (LOD) leviter inferior quam 2 ppm.E contra, quatenus NMR et MS notare consueverunt gradum crucis-coniunctio et/vel modificationis HA in saccharo fragmentis conexarum HA in fragmentis productorum HA.Propositum harum artium numquam fuit quantitare residua BDDE detectionis in tam humilibus concentrationibus quam in hoc articulo (LOD methodi nostrae LC-MS = 10 ppb describemus).
Post tempus: Sep-01-2021